Caracterisation des substances naturelles organiques présentes dans les objets du patrimoine par technique d'analyse chromatographiques et spectrales

Compte-rendu du stage de Master 2 recherche

Le premier objectif du travail confié à l’étudiante de master 2, Petra Slechticka, a été de transférer des méthodes d’analyse par chromatographie en phase gazeuse utilisant des colonnes de dimensions classiques (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) à des méthodes utilisant des colonnes dites « Fast » de dimensions réduites (par exemple : 15 m x 0,10 mm x 0,10 μm). L’intérêt de ces nouvelles colonnes est de réduire considérablement le temps d’analyse et d’améliorer le rapport signal sur bruit grâce à la finesse des pics chromatographiques obtenus. tl_files/patrima/projets/images/M2 LETIAM ImageRapportM2.jpgL’optimisation du transfert de méthodes consiste à trouver les conditions qui permettent de gagner le maximum de temps tout en gardant la même qualité de séparation. Les colonnes « Fast » n’avaient pas encore été utilisées au laboratoire et il a fallu premièrement trouver des conditions opératoires permettant de transférer correctement l’échantillon dans la colonne : pression de gaz vecteur, mode d’introduction (split ou splitless), géométrie du « liner » ... En effet, le faible diamètre de la colonne génère des pertes de charge beaucoup plus importantes que celles générées par les colonnes classiques. Il faut donc utiliser des pressions de gaz vecteur beaucoup plus importantes. Dans notre application, elle est passée de 100 kPa à 450 kPa. D’autre part, avec un injecteur de type split/splitless, qui passe par la vaporisation de l’échantillon avant son introduction dans la colonne, il faut toujours optimiser les conditions de transfert pour trouver un bon compromis entre la capacité de charge de la colonne et la sensibilité de la méthode. Les colonnes « Fast » ont une capacité de charge nettement plus faible que les colonnes classiques, du fait de la faible épaisseur du film de phase stationnaire et il faut donc introduire des quantités plus faibles d’échantillon pour éviter les phénomènes de saturation. Il a cependant été nécessaire d’utiliser des « liners » de faible diamètre (type splitless) et des rapports de split faibles (1/10) pour parvenir à introduire une quantité d’échantillon suffisante dans la colonne. Un paramètre, que l’on peut négliger avec les colonnes classiques, s’est révélé très important. Il s’agit du préchauffage de l’aiguille de la seringue dans l’injecteur avant l’introduction de l’échantillon. Ce préchauffage permet d’obtenir l’échantillon sous forme de spray et il apparaît absolument nécessaire quand on utilise des colonnes « Fast ». Les études préliminaires ont été effectuées avec le mélange test de Grob, mélange de douze composés provenant de familles chimiques différentes, qui permet d’évaluer la qualité du système de séparation (injecteur + colonne).
Par la suite, le but de l’étude a été de transférer une méthode qui permet de caractériser plusieurs classes de substances naturelles (gommes, tannins hydrolysables, résines, huiles, graisses et cires) à partir des composés obtenus à la suite du traitement de l’échantillon par méthanolyse acide et silylation. La méthode classique qui permet de séparer correctement tous les composés, si les différentes substances naturelles sont présentes dans le même échantillon, dure 110 minutes. Le transfert de méthode a été optimisé progressivement en considérant la séparation des composés résultant du traitement mentionné plus haut appliqué à différentes huiles et graisses, une gomme arabique, une gomme-résine oliban (cf. Annexe 1) et différents mélanges cire/résine (cf. Annexe 2). La méthode optimisée permet d’obtenir une bonne séparation de tous les composés avec une durée d’analyse de 16 minutes.
Le deuxième objectif a été d’optimiser une méthode de séparation destinée à caractériser les substances naturelles avec le minimum de transformation chimique. La mise en solution de l’échantillon dans le dichlorométhane permet d’éliminer les polysaccharides. L’évaporation du solvant est suivie d’une étape de silylation qui permet de mieux observer les composés présentant un groupement acide ou alcool. Si l’échantillon contient un corps gras (huile, graisse ou cire) le mélange obtenu après traitement de l’échantillon contient des cérides et/ou des triacylglycérides, composés à haut poids moléculaire qui nécessitent des conditions d’analyses adaptées, en particulier des colonnes résistant à la haute température (au-delà de 350°C). La méthode existante permet d’observer, en une seule analyse, un grand nombre de composés, avec une gamme de volatilités très étendue, mais les triglycérides sont mal séparés et donc difficiles à identifier avec certitude. L’objectif de l’étude a été de voir s’il était possible d’injecter le même échantillon, une seconde fois, avec la même colonne, dans des conditions de température plus favorables à l’identification des triacylglycérides. Il est en particulier nécessaire d’augmenter la température de l’injecteur. Il faut aussi démarrer la programmation de température du four à des températures beaucoup plus élevées pour atteindre plus vite la température d’élution des triacylglycérides et éviter les phénomènes d’élargissement des pics chromatographiques. Trois corps gras ont été testés : l’huile d’olive, le beurre et l’huile de coco. Pour l’huile d’olive, un problème de transfert de l’échantillon a été constaté ainsi qu’une dégradation partielle de l’échantillon. Les résultats sont nettement meilleurs pour le beurre et l’huile de coco (cf. Annexe 3) qui contiennent des triglycérides de poids moléculaire plus faibles. L’idéal serait de pouvoir utiliser l’injecteur « On column » qui permet d’introduire l’échantillon, sous forme liquide, directement dans la colonne et évite les phénomènes de discrimination et de dégradation. Cependant, l’injecteur dont nous disposons ne permet pas de démarrer la programmation de température du four au-delà de 80°C et devrait être modifié pour nous permettre de dépasser cette limite.
Une autre partie du travail a concerné la détermination rapide de la composition en acides gras de quelques huiles végétales. Cette détermination est effectuée sur des huiles de référence non mélangées avec d’autres substances naturelles. La composition en acides gras est obtenue après une transestérification par méthanolyse basique qui transforme rapidement les triacylglycérides en esters méthyliques d’acides gras et en glycérol. Une extraction à l’hexane permet d’éliminer le glycérol et d’isoler les esters méthyliques d’acides gras. Une méthode rapide de séparation et d’identification de ces derniers a été mise au point en utilisant une colonne polaire de longueur courte (10 m x 0,25 mm x 0,25 μm). La méthode a permis, entre autres, de comparer deux huiles siccatives : l’huile de lin et l’huile de bois de chine. Dans les deux huiles, le composé majoritaire, responsable de la siccativité, est un acide à 18 atomes de carbone et 3 doubles liaisons (C18 :3) mais des différences apparaissent au niveau de la position et de la stéréochimie des doubles liaisons. Dans l’huile de lin, l’acide α-linolénique, majoritaire, est l’acide tout cis-∆9,12,15 octadécatriénoïque alors que dans l’huile de bois de chine, l’acide α-éléostéarique, majoritaire, est l’acide cis, trans, trans-∆9,11,13 octadécatriénoïque. Dans ce dernier, les doubles liaisons sont conjuguées. Les différences qui existent entre ces deux isomères de position ont une répercussion très importante sur leur affinité avec la phase stationnaire et l’acide α-éléostéarique est beaucoup plus retenu que l’acide linolénique (cf. Annexe 4).
Quelques analyses ont été effectuées sur des échantillons provenant d’objets du patrimoine. La présence de résine de mélèze (térébenthine de Venise) a pu être clairement mise en évidence dans des prélèvements effectués sur une statuette en cire polychrome du XVIIIème siècle, conservée au musée de Coimbra, Portugal (cf. Annexe 5).
Enfin, le stage de M2 a été l’occasion de revenir sur des résultats obtenus lors d’un essai inter-laboratoire initié par le réseau italien PRIN07. Le but de cet essai était d’identifier les substances naturelles présentes dans une reproduction de recette pharmaceutique du XVIIème siècle. Une substance minoritaire, le galbanum, n’a été identifiée que par un seul laboratoire parmi les onze participants. Des analyses ont donc été effectuées sur les deux échantillons de galbanum disponibles au laboratoire : un galbanum « visqueux » et un galbanum « dry » provenant de la société Anselme à Marseille, sans origine botanique certifiée. Ces deux échantillons avaient déjà été analysés précédemment à une époque où nous passions en revue les gommes et gommes-résines mentionnées dans les textes anciens, en nous intéressant principalement à la caractérisation de la partie gomme. Les analyses effectuées après méthanolyse acide et silylation ont montré que l’un des échantillons est principalement constitué de polysaccharides (cf. Annexe 6) alors que l’autre en contient peu et contient majoritairement des composés très spécifiques (cf. Annexe 7), composés que nous avions observés lors de l’essai sans pouvoir en déterminer l’origine. Ces composés ont pu être identifiés après une recherche bibliographique minutieuse. Celle-ci nous a permis de constater que le galbanum, que l’on trouve mentionné dans de nombreux traités anciens, suscite un regain d’intérêt à cause de l’activité d’un des ses composants, l’acide galbanique, dans le traitement d’infections graves qui résistent aux antibiotiques classiques.

 

Détais d'organisation

Porteur:

  • Jean Bleton, LETIAM