Caractérisation de la colonisation de matériaux pierreux par la bactérie acidophile Thiobacillus thiooxidans en lien avec des processus de biodétérioration de monuments

Objectif

Mettre au point la culture d’espèces bactériennes retrouvées sur les monuments et impliquées dans la biodétérioration. Caractériser le métabolisme de certaines de ces bactéries par approche protéomique. Ce projet s'inscrit dans la continuité d'un projet financé par la Fondation l'année précédente.

 

Compte-rendu

La détérioration de pierres utilisées pour la construction de monuments est liée à des facteurs physico-chimiques environnementaux mais également à des facteurs biologiques. Dans le but de préserver ce patrimoine culturel, des travaux de recherche doivent être menés pour mieux comprendre les phénomènes de biodétérioration, les prévenir et y remédier.

Une microflore est présente sur les façades des monuments historiques, elle constitue un écosystème complexe. Cette colonisation tant à la surface qu’en profondeur des pierres est très largement le fait de la formation de biofilm. Parmi la flore microbienne colonisatrice pouvant être impliquée dans des phénomènes de biodétérioration, les bactéries chimiolithotrophes capables de produire des acides, jouent un rôle essentiel dans la dégradation des pierres calcaires. Parmi ces bactéries, les bactéries sulfo-oxydantes appartenant au genre Thiobacillus produisent de l’acide sulfurique (H2SO4) suite à l’oxydation de l’hydrogène sulfuré (H2S), du soufre élémentaire et de thiosulfates (S2O32−). En présence d’eau, cette production d’acide sulfurique dissout la calcite et conduit à la formation de gypse suivant l’équation : CaCO3 + H2SO4 → CaSO4 + H2CO3. La formation du gypse apparaît sous forme de plaques blanchâtres en surface des pierres et entraîne des dommages mécaniques par accumulation de cristaux. Cette dilatation "cristallochimique" altère la cohésion de la pierre. De plus, les particules de pollution atmosphérique pourront être piégées lors de la formation du gypse et créer des « croûtes noires » sur les façades des monuments. Les bactéries nitrifiantes (Nitrobacter, Nitrococcus) produisent de l’acide nitrique (HNO3) après oxydation de l’acide nitreux (HNO2), ce dernier étant produit  suite à l’oxydation de l’ammoniac (NH4+) par d’autres bactéries nitrifiantes (Nitrosomas, Nitrosococcus). Les acides sulfuriques et nitriques produits par cette microflore acidogène ont une action corrosive puissante sur la pierre. Peu de données existent dans la littérature sur l’adhérence et la formation de biofilm par cette flore acidogène. Le travail réalisé dans le cadre de ce projet financé par Patrima a comme objectif d’améliorer les connaissances des processus de colonisation de ces bactéries sur la pierre, et de leur métabolisme au sein des biofilms. Il a été mené en collaboration entre les laboratoires ERRMECe et le LRMH. Des souches acidogènes appartenant aux espèces Thiobacillus thiooxidans, Nitrosomanas europeae, et Thiobacillus denitrificans ont été étudiées. Des modèles de formation de biofilm sur lame de verre ont été mis en œuvre au laboratoire et des analyses protéomiques ont été menées.

 

Cultures des espèces Nitrosomonas europaea et Thiobacillus denitrificans en laboratoire

Capacité de croissance de N. europaea et T. denitrificans

Les deux souches de N. europaea et T. denitrificans utilisées sont capables d’oxyder des éléments minéraux comme l’ammoniac ou le soufre élémentaire afin de produire de l’énergie. La croissance en suspension de ces espèces bactériennes est relativement longue. Il a fallu attendre plus de 3 semaines pour voir apparaitre un léger trouble dans le milieu pour les 2 souches, signe d’une présence bactérienne relativement importante. On considère que l’apparition d’un trouble correspond à une quantité de 107 UFC/ml. Cette présence a été confirmée par visualisation au microscope optique, en réalisant un état frais (fig. 1). Les observations montrent une abondance relative suffisante pour mener à bien les analyses suivantes.

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Fig. 1 : visualisation en microscopie inversée de la croissance in vitro de Nitrosomonas europaea après 12 jours.

 

Malgré cette croissance lente, des précipités se forment en quelques jours au fond des flacons. Ce précipité est pigmenté en bleu pour la souche N. europaea, et est blanc pour la souche de T. denitrificans. Ce phénomène serait lié à la chélation d’ions métalliques présents dans le milieu de culture par les acides nitreux ou sulfurique produits par le métabolisme bactérien au cours de la croissance.

 

Suivi de la croissance bactérienne de Nitrosomonas europaea et Thiobacillus denitrificans à la surface de lames de verre

La formation de biofilm a été suivie dans un modèle de lamelle de verre immergée. L’avantage de ce modèle est de faciliter l’observation de la croissance microbienne sur une surface minérale par microscopie.

Pour N. europaea, la formation du biofilm sur lamelle de verre a été suivie pendant 12 jours. La quantité de cellules bactériennes, visualisée par le marquage au DAPI (fig. 2), augmente progressivement jusqu’à former des structures hétérogènes de densité variable.

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Fig. 2 : Formation de biofilm de N. europaea. Visualisation en microscopie confocale du marquage bactérien (DAPI) et des motifs saccharidiques par des lectines (TV-UE) aux jours 3, 6 et 12

 

Des polysaccharides extracellulaires sont marqués en vert et rouge par le couple de lectines TV-UE (fig. 2), apparaissant à partir du 6ème jour de croissance. De plus, ce marquage des polysaccharides n’est pas co-localisé avec le marquage des bactéries au DAPI. Au 12ème jour, il y a un très fort marquage par les deux types de lectines, les bactéries semblent avoir produit une quantité importante d’exopolysaccharides. De plus, le marquage est localisé autour de des bactéries ce qui signe la présence d’une matrice d’exopolymères de biofilm.

Cette structure a été analysée en épaisseur par microscopie confocale à balayage laser, révélant une épaisseur de 15 µm au 12ème jour (fig. 3).

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Fig. 3: Visualisation d’un biofilm de N. europaea. Imagerie en microscopie confocale d’une coupe en profondeur d’un biofilm de 12 jours montrant la répartition des polysaccharides de matrice autour des bactéries.

 

N. europaea est donc capable de former des biofilms monospécifiques sur lame de verre en s’entourant d’une matrice d’exopolysaccharides d’une quinzaine de micromètres d’épaisseur dans les conditions testées.

La formation de biofilm sur lame de verre par T. denitrificans a également été suivie pendant 12 jours. Le nombre de bactéries sur le verre augmente sensiblement tout au long de l’incubation. La colonisation bactérienne n’est pas homogène, avec la formation d’amas de densité variable (fig. 4). Le marquage vert par la lectine TV est co-localisé avec le marquage DAPI pendant toute la durée de formation du biofilm. Cette lectine révèle donc des polysaccharides de la paroi bactérienne. Le marquage rouge par la lectine UE est très faible pendant toute la durée de formation du biofilm.

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Fig. 4: Formation de biofilm de T. denitrificans. Visualisation en microscopie confocale du marquage bactérien (DAPI) et des motifs saccharidiques par des lectines (TV-UE) aux jours 3, 6 et 12.

 

Cette structure a été analysée en profondeur par microscopie confocale à balayage laser, révélant une épaisseur de 12 µm  le 10ème jour (fig. 5).

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Fig. 5: Visualisation d’un biofilm de T. denitrificans. Imagerie en microscopie confocale d’une coupe en profondeur d’un biofilm de 12 jours montrant la colocalisation des bactéries (DAPI) et des motif saccharidiques (lectines UE-TV).

 

Le verre est donc un support favorable à l’étude de la formation de biofilm pour les deux espèces acidogènes N. europaea et T. denitrificans.

 

Expression protéique de Thiobacillus thiooxidans en cultures libres

Essai de solubilisation des protéines totales d’une culture en suspension

La culture de T. thiooxidans  est lente, son temps de génération étant de 5 jours. Le souffre, ajouté à la surface de la solution et utilisé par le métabolisme du Thiobacillus, commence à précipiter au fond de l’erlenmeyer au bout de quelques jours montrant l’activité métabolique au défaut de voir apparaitre un trouble bactérien caractéristique d’une culture riche en bactéries. Cependant, comme pour les deux précédentes espèces étudiées, il faut attendre plusieurs semaines avant l’apparition d’un trouble dans le milieu, correspondant à une quantité bactérienne de 107 UFC/ml.

Pour extraire une quantité de protéines importante, il faut d’abord une quantité bactérienne abondante. Deux cultures bactériennes de 100 ml correspondant à deux durées de croissance différentes ont été utilisées : la solution A (6 semaines de culture) et la solution B (8 semaines). Après une première centrifugation, un culot bactérien de 0.3 g pour la solution A, et 0.4 g pour la solution B a été obtenu, puis solubilisé en présence d’urée pour le culot A et en présence d’un mélange urée/thiourée pour le culot B. Après éclatement des cellules par choc thermique et sonication, les protéines sont recueillies dans le surnageant par centrifugation. La quantité protéique obtenue est de 0.780 mg /ml pour la solution A et de 1.548 mg/ml pour la solution B. Cette différence de concentration protéique peut s’expliquer par un temps de croissance plus long pour la solution B, et/ou une meilleure solubilisation des protéines dans le tampon IEF B contenant un mélange urée/thio-urée.

 

Profil protéique de T. thiooxidans par électrophorèse bidimensionnelle

La première étape de séparation des protéines est l’iso-électro-focalisation : les protéines migrent sur une bandelette en gradient de pH (3-10) sous l’action d’un champ électrique jusqu’à atteindre leur point iso-électrique. Cette étape étant très importante pour la résolution de cette technique, différentes conditions de focalisation ont été testées.

En appliquant un courant de 60 kVh (condition 1), très peu de spots sont focalisés et on remarque de nombreuses trainées dues à la présence abondante d’acides nucléiques contaminants (fig. 6).

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Fig. 6 : Gel 2D  de T. thiooxidans. Dans cette figure est présenté un gel master (logiciel PDquest) contenant 265 spots protéiques détectés dans le gel original obtenu par électrophorèse bidimensionnelle d’un échantillon protéique de la suspension A, solubilisé dans du tampon IEF A (urée) et ayant reçu un produit total de 60 kVh lors de l’iso-électrofocalisation.

 

En revanche en appliquant un courant dont le produit total est 2 fois plus important (condition 2), le nombre de spots protéiques révélés et focalisés est nettement plus élevé (fig. 7).

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Fig. 7 : Gel 2D  de T. thiooxidans.Dans cette figure, est présenté un gel master contenant 374 spots protéiques détectés dans le gel original obtenu par électrophorèse bidimensionnelle d’un échantillon protéique de la suspension A, solubilisé dans du tampon IEF A (urée) et ayant reçu un produit total de 120 kVh lors de l’iso-électrofocalisation.

 

Pour la séparation des protéines de la suspension B, 3 conditions ont été testées afin d’améliorer la focalisation : les conditions 1 et 2 (60 et 120 kVh, respectivement, fig. 8-9) et la condition 3 avec une intensité de courant plus élevée (200kVh, fig. 10).

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Fig. 8 : Gel 2D  du protéome de T. thiooxidans (condition 1).Dans cette figure, sont présentés, un gel master contenant les 144 spots protéiques détectés dans le gel original obtenu par électrophorèse bidimensionnelle d’un échantillon protéique de la suspension B, solubilisé dans du tampon IEF B (urée/thio-urée) et ayant reçu un produit total de 60 kVh lors de l’iso-électrofocalisation.

 

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Fig. 9 : Gel 2D  du protéome de T. thiooxidans (condition 2).Dans cette figure, sont présentés, un gel master contenant les 151 spots protéique détectés dans le gel original obtenu par électrophorèse bidimensionnelle d’un échantillon protéique de la suspension B, solubilisé dans du tampon IEF B (urée/thio-urée) et ayant reçu un produit total de 60 kVh lors de l’iso-électrofocalisation.

 

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Fig. 10 : Gel 2D  du protéome de T. thiooxidans (condition 3).Dans cette figure, sont présentés, un gel master contenant les 265 spots protéique détectés dans le gel original obtenu par électrophorèse bidimensionnelle d’un échantillon protéique de la suspension B, solubilisé dans du tampon IEF B (urée/thio-urée) et ayant reçu un produit total de 60 kVh lors de l’iso-électrofocalisation.

 

La condition 3 permet d’obtenir une focalisation plus nette et une quantité de spots protéiques supérieure aux deux conditions précédentes mais relativement peu importante (fig. 10).

Les conditions ayant permis d’obtenir de la carte protéique la plus nette de Thiobacillus thiooxidans avec le plus grand nombre de spots focalisés, sont donc l’utilisation de tampon IEF sans thio-urée pour resuspendre le culot bactérien avant l’extraction des protéines, et en appliquant un courant élevé pour la focalisation iso-électrique.

 

Conclusions

Nous avons pu suivre la croissance en mode planctonique et en mode biofilm ainsi que la sécrétion d’exopolymères de matrice sur lamelle de verre pour Nitrosomonas europaea et Thiobacillus denitrificans. La carte protéique de Thiobacillus thiooxidans sous forme planctonique a été obtenue, même si elle n’est pas encore exhaustive. La résolution en 2-DE de cette carte devra être améliorée.

 

Résultats principaux

  • Les souches testées de N. europaea et T. denitrificans ont une croissance lente in vitro en mode planctonique dans les conditions testées. La formation d’un précipité en culture liquide est un marqueur précoce de l’activité et de la croissance de ces bactéries.
  • Le verre est un support favorable à l’étude de la formation de biofilm pour les deux espèces acidogènes N. europaea et T. denitrificans. Ces bactéries forment des biofilms d’épaisseur variant d’une douzaine à une quinzaine de micromètres en 12 jours dans les conditions testées. Parmi les exopolymères de matrice de ces biofilms, on trouve des polysaccharides que l’on a pu observer après marquage par des lectines couplées à des fluorochromes.
  • La carte du protéome total de Thiobacillus thiooxidans sous forme planctonique a été établie. Elle devra être complétée en améliorant la résolution de l’électrophorèse bidimensionnelle et l’identification des spots protéiques.

 

Détails d'organisation

Stage de M2.

Porteurs :

  • Patrick DI MARTINO (ERREMECe, UCP)
  • Damien SEYER (ERREMECe, UCP)

Réalisation :

Janvier-juin 2013.